# NOM-089-SSA1-1994 Bienes y Servicios. Métodos para la determinación del contenido microbiano en productos de belleza. Fuente: https://platiica.economia.gob.mx/normalizacion/nom-089-ssa1-1994/ Estado informado por la fuente: Vigente Disponibilidad local: texto - > Enlace al último Informe de revisión: - Clave de la Norma: NOM-089-SSA1-1994 - Comité que desarrolló la Norma: Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario - Dependencia(s): Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios - Estado de la Norma: Vigente - Fecha de entrada en vigor: 25/10/1995 - Fecha de publicación en el DOF: 25/9/1995 - Grado: no equivalente - Producto, servicio, proceso o sistema: Contenido microbiano en productos de belleza - Título de la Norma: Bienes y Servicios. Métodos para la determinación del contenido microbiano en productos de belleza. ## PDF enlazado por la ficha oficial Tipo de publicación: pdf Relación con la ficha: principal Fuente del documento: https://platiica.economia.gob.mx/wp-content/uploads/sites/2/PDF_Normas_Publicas/089-ssa1.pdf Recuperación pendiente o parcial; consultar el archivo y la fuente original. ## NORMA Oficial Mexicana NOM-089-SSA1-1994, Bienes y servicios. Métodos para la determinación del contenido microbiano en productos de belleza. Tipo de publicación: norma Relación con la ficha: principal Fuente del documento: https://sidof.segob.gob.mx/notas/docFuente/4882015 Recuperación pendiente o parcial; consultar el archivo y la fuente original. [Documento con formato](/normas/nom-089-ssa1-1994/documentos/dof-4882015/) ## PROYECTO de Norma Oficial Mexicana NOM-089-SSA 1-1994, Bienes y servicios. Métodos para la determinación del contenido microbiano en productos de belleza. Tipo de publicación: proyecto Relación con la ficha: historial Fuente del documento: https://sidof.segob.gob.mx/notas/docFuente/4724717 [Documento con formato](/normas/nom-089-ssa1-1994/documentos/dof-4724717/) Texto derivado para búsqueda; consultar el documento con formato para tablas e imágenes. PROYECTO de Norma Oficial Mexicana NOM-089-SSA 1-1994, Bienes y servicios. Métodos para la determinación del contenido microbiano en productos de belleza.   Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.- Secretaría de Salud.- Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario. PROYECTO DE NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-089-SSA 1-1994. BIENES Y SERVICIOS. METODOS PARA LA DETERMINACION DEL CONTENIDO MICROBIANO EN PRODUCTOS DE BELLEZA. MERCEDES JUAN LOPEZ, Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, con fundamento en el artículo 39 de la Ley Orgánica de la Administración Pública Federal; 3 fracción XXII, 13, 194 fracción I, 197, 199, 401 Bis, 401 Bis I, 401 Bis 2 de la Ley General de Salud; 3 fracción XI, 38 fracción II, 40 fracciones I, VI, VIII, XI, XIII, 41, 43, 44, 45, 47, 50, 53 de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización y los aplicables al Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Control Sanitario de Actividades, Establecimientos, Productos y Servicios; y 13 fracción I del Reglamento Interior de la Secretaría de Salud me permito ordenar la publicación en el Diario Oficial de la Federación del proyecto de Norma Oficial Mexicana NOM-089-SSA 1-1994, Bienes y servicios. Métodos para la determinación del contenido microbiano en productos de belleza. El presente proyecto de Norma Oficial Mexicana se publica a efecto de que los interesados dentro de los siguientes 90 días naturales, contados a partir de la fecha de su publicación presenten sus comentarios ante el Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, sito en Lieja número 7, primer piso, colonia Juárez, código postal 06696, México,D.F. Durante el plazo mencionado, los análisis que sirvieron de base para la elaboración del proyecto de norma estarán a disposición del público para su consulta en el domicilio del Comité. México, D.F., a 11 de abril de 1994. INDICE   0.            INTRODUCCION   1.            OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACION   2.            FUNDAMENTO   3.            DEFINICIONES   4.            SIMBOLOS Y ABREVIATURAS   5.            REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO   6.            MATERIAL Y EQUIPO   7.            CUENTA TOTAL DE HONGOS, LEVADURAS Y DE MESOFILICOS AEROBIOS   8.            IDENTIFICACION DE PATOGENOS   9.            OBSERVANCIA DE LA NORMA 10.           CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES 11.           BIBLIOGRAFIA PREFACIO En la elaboración de la presente Norma participaron los siguientes organismos e instituciones: SECRETARIA DE SALUD Laboratorio Nacional de Salud Pública. Dirección de Control Sanitario de Bienes y Servicios. UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO. Facultad de Química. AVON COSMETICS, S.A. DE C.V. BEIERSDORF DE MEXICO, S.A. DE C.V. CLAIROL DE MEXICO, S.A. DE C.V. GILLETTE DE MEXICO, S.A. DE C.V. YVES ROCHER DE MEXICO, S.A. DE C.V. NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-089-SSA 1-1994. METODOS PARA LA DETERMINACION DEL CONTENIDO MICROBIANO EN PRODUCTOS DE BELLEZA. 0 Introducción Las disposiciones de la presente Norma Oficial Mexicana son de orden público e interés social y establecen los métodos para la determinación del contenido microbiano en productos de belleza, para asegurar que están libres de contaminación y son aptos para uso humano, de acuerdo con lo establecido por la Ley General de Salud, su Reglamento y demás disposiciones aplicables de la Secretaría de Salud. 1 Objetivo y campo de aplicación 1.1 Esta Norma Oficial Mexicana establece los métodos de prueba para determinar el contenido microbiano en productos de belleza con el fin de conocer la calidad sanitaria y precisar si son aptos para uso humano. 1.2 Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas físicas o morales que requieran efectuar estos métodos. 2 Fundamento Colocar una cantidad determinada de cosméticos o productos de belleza en medios de cultivo apropiados para poner de manifiesto la contaminación microbiana por bacterias, hongos y levaduras; después de su incubación realizar la cuenta del desarrollo e identificar los microorganismos potencialmente patógenos. 3 Definiciones Para los efectos de esta Norma se establecen las siguientes: 3.1 Aeróbico, es un microorganismo capaz de crecer en presencia de oxígeno libre. 3.2 Anaeróbico, es un microorganismo capaz de crecer en ausencia de oxígeno libre. 3.3 Aséptico, libre de microorganismos que son capaces de causar contaminación o enfermedad. 3.4 Bacterias, son microorganismos unicelulares que derivan del reino vegetal, incluidos en el grupo de los Schycomysetes; su tamaño es variable y oscila entre 0,5-2µ, algunos tienden a formar filamentos y pueden llegar a medir 30-40µ. Por su forma se encuentran esféricas (cocos), bastones (bacilos) y espirales (vibrio), se reproducen por bipartición. 3.5 Contenido microbiano, es el número de microorganismos mesofílicos aerobios viables, hongos, levaduras y microorganismos objetables (patógenos) presentes en productos de belleza, que determina si el producto es apto para el uso humano. 3.6 Estéril, medio totalmente libre de microorganismos. 3.7 Hongos, son organismos pertenecientes al reino Fungi, que se caracterizan por tener un cuerpo formado por estructura filamentosa con ramificaciones, que se conocen con el nombre de hifas, el conjunto de hifas constituye el micelio, carecen de clorofila, se alimentan por absorción, pudiendo propagarse por esporas flageladas o no, las paredes celulares pueden ser de queratina, celulosa y/o manana, macro o microscópicas y su coeficiente de sedimentación del RNA m es de 25 S. Incluyen los órdenes: Basidiomicetes, Ascomicetes, Deuteromicetes y Zygomicetes. 3.8 Levaduras, son un grupo de hongos cuya forma dominante de crecimiento es unicelular. Poseen un núcleo y se multiplican por reproducción sexual o asexual. La forma común de reproducción es asexual, por gemación o por fisión transversal. La reproducción sexual, cuando ocurre, es por medio de ascosporas contenida en un saco o asca. 3.9 Medio, cualquier material líquido, sólido o semisólido, que soporta el crecimiento de microorganismos. Se le denomina medio de cultivo a las diferentes mezclas de sustancias nutritivas empleadas en el laboratorio para el cultivo de microorganismos. 3.10 Medios diferenciales, son los que permiten distinguir entre las colonias de un organismo determinado y las de otro. 3.11 Medios enriquecidos, son los que favorecen en general el desarrollo de los microorganismos. 3.12 Medios múltiples, son medios que tienen incluidas sustancias que nos permiten determinar una prueba bioquímica. Usualmente dichos medios contienen dos o más pruebas al mismo tiempo. 3.13 Medios selectivos, son medios sólidos que permiten el crecimiento de una clase de organismos, mientras que inhibe el de otros. 3.14 Organismos coliformes, son bacilos gram negativos, aerobios, no esporulados, que fermentan la lactosa con producción de gas dentro de 48 horas cuando se incuban a 32°-35°C. Una variedad de bacterias, muy abundantes y siempre presentes en la materia fecal del hombre y animales superiores; también pertenecen a ese grupo ciertas bacterias propias del suelo y vegetales. 3.15 Patógeno, un organismo que es capaz de causar enfermedad a un animal o planta. 4 Símbolos y abreviaturas Cuando en esta Norma se haga referencia a los siguientes símbolos y abreviaturas se entiende por: UFC                          Unidad formadora de colonias lb                               libras g                                gramos ml                              mililitros µ                                micras °C                              grados Celsius p/v                              peso sobre volumen v/v                              volumen sobre volumen c.b.p.                         cuanto basta para Q.P.                           químicamente puro UV                             ultravioleta HCl                            ácido clorhídrico DNA                          ácido desoxirribonucleasa H 2 S                            ácido sulfhídrico EMB                          agar eosina azul de metileno AEM                           agar extracto de malta LIA                             agar hierro y lisina TSI                             agar hierro y triple azúcar ALM                           agar Letthen modificado AMC                          agar Mac Conkey PDA                           agar papa dextrosa AVJ                            agar Vogel Johnson CDS                          caldo dextrosa Sabourand BHI                            caldo infusión de cerebro corazón CLM                          caldo Letthen modificado MIO                            medio indol ornitina MR-VP                      medio rojo de metilo Voges Proskauer 5 Reactivos y medios de cultivo Los reactivos empleados en esta prueba deben ser grado analítico a menos que se indique otra cosa. Cuando se hable de agua debe entenderse agua destilada. 5.1 Reactivos Aceite mineral Acetona Acido acético 5 N Acido clorhídrico                        Acido oxálico Acido sulfanílico Acido tartárico     Alcohol amílico o butílico               Alfa naftilamino Amoníaco concentrado Cloruro de sodio Cristal violeta Diclrohidrato de N-N-dimetil p-fenilendiamina Etanol absoluto Fosfato monobásico de potasio Hidróxido de potasio Hidróxido de sodio al 10% 1-Naftol Oxalato de amonio Para dimetilamino benzaldehído Peróxido de hidrógeno Plasma de conejo o cobayo Rojo de metilo Safranina O Sulfato de cobre Telurito de potasio Tween 80 Yodo Yoduro de potasio Zinc en polvo 5.2 Medios de cultivo Agar cetrimida Agar citrato de Simmons Agar DNA azul-toluidina Agar eosina azul de metileno   Agar extracto de malta   Agar hierro y lisina Agar hierro y triple azúcar Agar Letthen modificado Agar McConkey    Agar pseudomona F Agar pseudomona P Agar papa dextrosa                 Agar sal-manitol           Agar sulfito de bismuto   Agar verde brillante Agar Vogel-Johnson Agar xilosa lisina desoxicolato (agar XLD) Base de caldo terationato Caldo cistina selenito Caldo Dextrosa Sabourand      Caldo infusión de cerebro corazón Caldo Letthen modificado Caldo lisina descarboxilasa Caldo urea Medio basal O/F (oxidativo-fermentativo) Medio indol ornitina Medio indol nitrito Medio rojo de metilo Voges Proskauer Medio SIM Tiras API para pruebas bioquímicas 5.3 Preparación de reactivos y medios de cultivo 5.3.1 Reactivos: 5.3.1.1 Solución salina al 0,85% Cloruro de sodio 8,5           g Agua c.b.p.             1000,0    ml Disolver el cloruro de sodio en 500 ml de agua, aforar a 1000 ml, ajustar el pH a 7,2 ± 0,1, filtrar, envasar y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. 5.3.1.2 Solución de etanol 80% y HCI al 1% v/v Etanol     80,0         ml HCl          1,0           ml Agua c.b.p.             100,0       ml Mezclar el etanol y el HCl, aforar a 100 ml con agua y envasar. 5.3.1.3 Solución de tween 80% Tween 80% sin diluir Envasar y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. 5.3.1.4 Aceite mineral Envasar y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. 5.3.1.5 Solución de Acido Tartárico al 10% p/v Acido Tartárico      10,0         g Agua c.b.p.             100,0       ml Disolver el ácido tartárico en 50 ml de agua, aforar a 100 ml, envasar y esterilizar en autoclave a 121° C durante 15 minutos. 5.3.1.6 Solución de telurito de potasio al 1% p/v Telurito de potasio               1,0           g Agua c.b.p.             100,0       ml Disolver el telurito en 50 ml de agua, aforar a 100 ml, envasar y esterilizar en autoclave a 121° C durante 15 minutos. 5.3.1.7 Solución de yodo-yoduro de potasio p/v Yodo        6,0           g Yoduro de potasio                5,0           g Agua        20,0         ml Disolver el yoduro de potasio en el agua y en esta solución disolver el yodo. Conservar en envases protegidos de la luz. 5.3.1.8 Solución de agua oxigenada al 3% v/v Peróxido de hidrógeno        3,0           ml Agua c.b.p.             100,0       ml Mezclar el peróxido en agua, aforar a 100 ml y envasar 5.3.1.9 Solución indicadora rojo de metilo Rojo de metilo      0,1           g Alcohol al 95%      300,0       ml Agua c.b.p.             500,0       ml Mezclar el rojo de metilo en el alcohol y diluir con agua a 500 ml. 5.3.1.10 Reactivo de Griess-Ilosvays Solución A   Acido sulfanílico   8,0           g Acido acético 5N   1000,0    ml El ácido acético 5N se prepara agregándole un volumen de ácido acético glacial a 2,5 volumen de agua. Mezcle bien, añada luego el ácido sulfanílico y vuelva a mezclar. Solución B Alfa naftilamina     8,0           g Acido acético 5N   1000,0    ml Mezclar y almacenar en refrigeración (4ºC) cuando no esté en uso. Generalmente ambos reactivos son estables aproximadamente durante 3 meses. 5.3.1.11 Reactivo de Kovacs y Ehrlich Para-dimetil-amino-benzaldehído    5,0           g Alcohol amílico o butílico    75,0         ml Acido clorhídrico (37%) Q.P.              25,0         ml Disuelva el para-dimetil-amino-benzaldehído en el alcohol. Caliente suavemente la solución en un baño de agua tibia. Una vez disueltos los ingredientes, agregue el ácido clorhídrico con cuidado. 5.3.1.12 Reactivo de O'Meora Hidróxido de potasio           40,0         g Agua        100,0       ml Disolver y enfriar. Añadir 0,3 g de creatinina (monohidrato). La solución reactiva, lista para el uso, puede conservarse en refrigeración (+4ºC) durante 4 semanas aproximadamente. 5.3.1.13 Solución de sulfato de cobre según Leifson. Sulfato de cobre   1,0           g Amoníaco concentrado       40,0         ml Solución de sosa potásica al 10%   690,0       ml Disolver el sulfato de cobre con amoníaco concentrado y añadir hidróxido de potasio al 10% que ha sido preparada con hidróxido de potasio. 5.3.1.14 Reactivo de Barrit 1-naftol A                5,0           g Alcohol absoluto   100,0       ml Disolver el 1-naftol en el alcohol y envasar. 5.3.1.15 Solución de cristal violeta Solución A Cristal violeta        2,0           g Alcohol etílico al 95%          200,0       ml Solución B Oxalato de amonio               0,8           g Agua        80,0         ml Disolver cada una de las soluciones por separado, mezclar las soluciones A y B, dejar reposar. 5.3.1.16 Solución yodo-yodurada Yoduro de potasio                2,0           g Yodo        1,0           g Agua        100,0       ml Triturar en un mortero el yodo y el yoduro de potasio, adicionar el agua necesaria para que se disuelva el yodo, agregar agua hasta un volumen de 100 ml. Conservar protegido de la luz. 5.3.1.17 Solución safranina Safranina "O"         2,5           g Alcohol etílico al 95%          100,0       ml Disolver la safranina "O" en el alcohol etílico. Tomar 10 ml de esta solución y llevar a 100 ml con agua. Agitar. 5.3.1.18 Solución alcohol-acetona Partes iguales de acetona y alcohol etílico al 95%. 5.3.2 Medios de cultivo Los medios de cultivo pueden prepararse a partir de medios comerciales deshidratados o con los ingredientes que se especifican a continuación. 5.3.2.1 Medios nutritivos o de enriquecimiento 5.3.2.1.1 Agar Letheen modificado (ALM) Agar Letheen (Difco o BBL)                32,0         g Peptona de caseína            5,0           g Peptona de carne                 10,0         g Extracto de levadura            2,0           g Cloruro de sodio 5,0           g Bisulfito de sodio                 0,1           g Agar         5,0           g Agua        1000,0    ml pH final después de esterilizar 7,2 ± 0,2. Mezclar los componentes y calentar con agitación hasta la disolución completa del agar. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. 5.3.2.1.2 Caldo Letheen modificado (CLM) Caldo Letheen (Difco o BBL)             26,7         g Peptona de caseína            5,0           g Peptona de carne                 10,0         g Extracto de levadura            2,0           g Bisulfito de sodio                 0,1           g Agua        1000,0    ml pH final después de esterilizar 7,2 ± 0,2 Mezclar los componentes hasta la disolución completa y distribuír 95 ml en botellas con tapón de rosca para    dilución. Esterilizar en autoclave a 121° C durante 15 minutos. 5.3.2.1.3 Agar papa dextrosa (PDA) Infusión de papa 200,0       ml Dextrosa                 20,0         g Agar         15,0         g Agua        1000,0    ml pH final 5,6 ± 0,2 Suspender los ingredientes en un litro de agua agitando remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante un minuto. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Antes de usarse se licua, se enfría a 45-50ºC, se ajusta el pH a 3,5 con una solución de ácido tartárico al 10%. 5.3.2.1.4 Base de caldo tetrationato Mezcla de peptonas             5,0           g Mezcla de sales biliares     1,0           g Carbonato de calcio            10,0         g Tiosulfato de sodio              30,0         g Agua        1000,0    ml pH final 7,0 ± 0,1 Suspender el medio deshidratado en un litro de agua. Mezclar bien y calentar a ebullición. Dejar enfriar y envasar en tubos de ensayo estériles, en volúmenes de 10 ml cada uno. Guardar en refrigeración. No esterilizar en autoclave. Momentos antes de usarlo agregar 0,2 ml (de 3 a 4 gotas) de la solución yodo-yoduro de potasio (5.3.1.7) a cada tubo. Usar el medio el mismo día en que se le agrega la solución de yodo. 5.3.2.1.5 Caldo Dextrosa Sabouraud (CDS) Polipeptona o neopeptona                 10,0         g Dextrosa                 40,0         g Agua        1000,0    ml pH después de esterilizar   5,6 ± 0,2 Suspender el medio deshidratado en un litro de agua. Remojar de 10 a 15 minutos. Mezclar bien hasta obtener una suspensión uniforme. Calentar agitando frecuentemente durante un minuto. Distribuir y esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. No sobrecalentar ya que por su alto contenido en carbohidratos se obscurece y pierde eficacia. 5.3.2.2 Medios selectivos y diferenciales 5.3.2.2.1 Agar Mac Conkey (AMC) Digerido pancreático de gelatina      17,0         g Digerido pancreático de caseína      1,5           g Digerido péptico de tejido animal     1,5           g Lactosa 10,0         g Mezcla de sales biliares     1,5           g Cloruro de sodio 5,0           g Agar         13,5         g Rojo neutro            0,03         g Cristal violeta        0,001       g Agua        1000,0    ml pH después de esterilizar 7,1 ± 0,2 Suspender el medio deshidratado en 1000 ml de agua, remojar de 10 a 15 minutos y calentar a ebullición agitando continuamente. Hervir durante un minuto, esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Enfriar a 45-50ºC y vaciar en cajas Petri unos 20 ml por placa. Dejar solidificar y luego invertir las cajas para evitar que se deposite un exceso de humedad en la superficie del medio. 5.3.2.2.2 Agar Vogel - Johnson (AVJ) Digerido pancreático de caseína                                                                                     10,0          g Extracto de levadura                                                                                                              5,0          g Manitol                                                                                                                                   10,0          g Fosfato dibásico de potasio                                                                                                5,0          g Cloruro de litio                                                                                                                        5,0          g Glicina                                                                                                                             10,0          g Agar                                                                                                                                        16,0          g Rojo de fenol                                                                                                                    0,025     g Agua                                                                                                                                  1000,0          ml pH después de esterilizar   7,2 ± 0,2 Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, mezclar, dejar remojar de 5 a 10 minutos. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante un minuto. Distribuir y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Enfriar el medio entre 45y 50ºC y adicionar 20 ml de una solución estéril al 1% de telurito de potasio. Agitar vigorosamente y distribuir unos 20 ml en cajas de Petri. 5.3.2.2.3 Agar de sal manitol. Digerido pancreático de caseína                                                                                 5,0      g Digerido péptico de tejido animal                                                                                5,0      g Extracto de carne                                                                                                             1,0      g D. manitol                                                                                                                       10,0      g Cloruro de sodio                                                                                                           75,0      g Agar                                                                                                                                  15,0      g Rojo de fenol                                                                                                                    0,025     g Agua                                                                                                                            1000,0      ml. pH después de esterilizar   7,4 ± 0,2 Suspender el medio deshidratado en un litro de agua y remojar 15 minutos. Mezclar y calentar a ebullición durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Distribuir porciones de 20 ml en cajas Petri de 15x100 mm. 5.3.2.2.4 Agar cetrimida Digerido pancreático de gelatina      20,0         g Cloruro de magnesio          1,4           g Sulfato de potasio                10,0         g Agar         13,6         g Cetil bromuro de trimetil amonio (cetrimida)                 0,3           g Glicerol   10,0         ml Agua        1000,0    ml pH después de esterilizar 7,2 ± 0,2 Disolver en agua los componentes sólidos antes de adicionar el glicerol. Remojar unos 10 minutos. Calentar agitando frecuentemente y hervir un minuto. Distribuir y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. 5.3.2.2.5 Agar eosina azul de metileno. (EMB) Digerido pancreático de gelatina     10,0         g Fosfato dibásico de potasio              2,0           g Agar         15,0         g Lactosa 10,0         g Eosina "Y"              0,4           g Azul de metileno (Metiltionína)           0,065       g Agua        1000,0    ml pH después de esterilizar   7,1 ± 0,2 Disolver el digerido pancreático de gelatina, el fosfato dibásico de potasio y el agar en el agua. Esterilizar.   Dejar enfriar y antes de utilizar agregar las siguientes   soluciones a cada 100 ml de agar líquido; 5 ml de solución   1:5 de lactosa, 2 ml de solución 1:50 de eosina "Y" y 2 ml de solución 1:300 de azul de metileno. Mezclar. 5.3.2.2.6 Agar extracto de malta (AEM) Extracto de malta 30,0         g Agar         20,0         g Agua        1000,0    ml pH después de esterilizar   5,5 ± 0,2 Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, homogeneizar y remojar de 10 a 15 minutos, calentar agitando frecuentemente, hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Si el medio se sobrecalienta el agar perderá su capacidad de gelificarse. Enfriar de 47 - 50ºC y ajustar el pH a 3,5 con una solución de ácido tartárico al 10% estéril. 5.3.2.2.7 Caldo infusión de cerebro corazón (BHI) Infusión de cerebro de ternera          200,0       g Infusión de corazón de res                 250,0       g Peptona de gelatina            10,0         g Dextrosa                 2,0           g Cloruro de sodio 5,0           g Fosfato disódico   2,5           g Agua        1000,0    ml pH final 7,4 ± 0,2 Suspender el medio deshidratado en un litro de agua y calentar ligeramente si es necesario. Se puede agregar 0,1% de agar si se desea. Envasar y esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. 5.3.2.2.8 Agar verde brillante. Extracto de levadura                                                                                                        3,0      g Mezcla de peptonas                                                                                                      10,0      g Cloruro de sodio                                                                                                              5,0      g Lactosa                                                                                                                           10,0      g Sacarosa                                                                                                                        10,0      g Rojo de fenol                                                                                                                    0,08   g Agar                                                                                                                                  20,0      g Verde brillante                                                                                                                  0,125     g Agua                                                                                                                            1000,0      ml pH final 6,9 ± 0,2 Suspender el medio deshidratado en un litro de agua y dejar remojar unos 15 minutos. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos, dejar enfriar a 45-50ºC y distribuír en cajas de Petri estériles. 5.3.2.2.9 Agar xilosa lisina desoxicolato (agar XLD) Xilosa                                                                                                                                                                3,5 ---------- g L-Lisina                                                                                                                                                            5,0 ---------- g Lactosa                                                                                                                                                            7,5 ---------- g Sacarosa                                                                                                                                                         7,5 ---------- g Cloruro de sodio                                                                                                                                            5,0 ---------- g Extracto de levadura                                                                                                                                      3,0 ---------- g Rojo de fenol                                                                                                                                                   0,08 -------- g Agar                                                                                                                                                                   13,5 -------- g Desoxicolato de sodio                                                                                                                                  2,5 ---------- g Tiosulfato de sodio                                                                                                                                        6,8 ---------- g Citrato de hierro y amonio                                                                                                                            0,8 ---------- g Agua                                                                                                                                                                  1000,0 --- ml pH final 7,4 ± 0,2 Suspender el medio deshidratado en un litro de agua y dejar que se remoje de 10 a 15 minutos. Calentar con todo cuidado y agitando con frecuencia justamente hasta que el medio hierva. No sobrecalentar. Transfiera al baño de agua dejar enfriar a 50ºC y verter en cajas de Petri. El medio debe ser transparente y color rojo rubí anaranjado. El calentamiento excesivo o el mantener demasiado tiempo en baño de agua, puede ocasionar que se formen precipitados. En este caso se corre el riesgo de que las colonias sean de menor tamaño y presenten reacciones menos nítidas. Sin embargo el precipitado no perjudica el desarrollo bacteriano y puede eliminarse por filtración con papel filtro. 5.3.2.2.10 Agar Pseudomona F       Peptona de caseína                                                                                                                                      10,0 -------- g Peptona de carne                                                                                                                                           10,0 -------- g Sulfato de magnesio                                                                                                                                     1,5 ---------- g Hidrogenofosfato dipotásico                                                                                                                       1,5 ---------- g Agar-agar                                                                                                                                                         12,0 -------- g Glicerina                                                                                                                                                           10,0 ------ ml Agua                                                                                                                                                                  1000,0 --- ml pH después de esterilizar 7,2 ± 0,2 Disolver en agua los componentes sólidos, adicionar la glicerina. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave 15 minutos a 121ºC. Dejar solidificar los tubos en posición inclinada o bien verter en placas. 5.3.2.2.11 Agar Pseudomona P Peptona de gelatina                                                                                                                                      20,0 -------- g Cloruro de magnesio                                                                                                                                    1,4 ---------- g Sulfato potásico                                                                                                                                              10,0 -------- g Agar-agar                                                                                                                                                         12,6 -------- g Glicerina                                                                                                                                                           10,0 ------ ml Agua                                                                                                                                                                  1000,0 --- ml pH después de esterilizar 7,2 ± 0,2 Disolver en agua los componentes sólidos, adicionar la glicerina. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave 15 minutos a 121ºC. Dejar solidificar los tubos en posición inclinada o bien verter en placas. 5.3.2.2.12 Caldo Cistina Selenito Mezcla de peptonas                                                                                                        5,0      g Lactosa                                                                                                                              4,0      g Fosfato de sodio                                                                                                           10,0      g Selenito ácido de sodio                                                                                                 4,0      g Cistina                                                                                                                               0,01   g Agua                                                                                                                            1000,0      ml pH final 7,0 ± 0,2 Suspender 23 g del polvo en un litro de agua desionizada. Mezclar bien y calentar ligeramente hasta que el medio se disuelva. Envasar en tubos de ensaye, preferiblemente con tapas de rosca, volúmenes entre 10 y 15 ml por tubo. Esterilizar a vapor fluente durante 15 minutos. No en autoclave. No sobrecalentar. El medio así preparado y herméticamente tapado puede conservarse en buenas condiciones, hasta 3 meses en refrigeración. 5.3.2.2.13 Agar Sulfito y Bismuto Mezcla de peptonas                                                                                                      10,0      g Extracto de carne                                                                                                             5,0      g Dextrosa                                                                                                                            5,0      g Fosfato disódico                                                                                                              4,0      g Sulfato ferroso                                                                                                                  0,3      g Indicador de sulfito de bismuto                                                                                    8,0      g Verde brillante                                                                                                                  0,025               g Agar                                                                                                                                  20,0      g Agua                                                                                                                            1000,0      ml pH final 7,5 ± 0,2 Suspender el polvo en un litro de agua, mezclar bien y remojar el medio deshidratado de 10 a 15 minutos para obtener un buen gel. Hervir no más de un minuto agitando continuamente para que se disuelva completamente el agar. Dejar que el medio se enfríe a 45ºC y sin dejar de agitarlo vacíe en cajas de Petri no menos de 20 ml de medio fluido. Las placas deben permanecer parcialmente descubiertas hasta que se seque la superficie del medio y usarlos el mismo día. Evite el sobrecalentamiento. 5.3.3 Medios para pruebas bioquímicas 5.3.3.1 Medio Basal O/F (de Hugh y Leifson) Peptona Caseína                                                                                                            2,0      g Cloruro de sodio                                                                                                              5,0      g Fosfato dipotásico                                                                                                           0,3      g Azul bromotimol                                                                                                               0,03   g Agar                                                                                                                                    2,5      g Agua                                                                                                                            1000,0      ml pH final 7,1 ± 0,2 Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando con frecuencia hasta disolver el agar. Agregar 10 ml de solución de glucosa al 10% esterlizada por filtración (o del azúcar apropiado) por cada 100 ml del medio fluido. Mezclar y distribuir asépticamente 5 ml en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar en autoclave a 118ºC durante 10 minutos a fin de evitar la degradación del azúcar. El medio tiene un color verde. 5.3.3.2 Medio Indol Ornitina (MIO) Extracto de levadura                                                                                                        3,0      g Peptona                                                                                                                           10,0      g Triptona                                                                                                                           10,0      g L-ornitina                                                                                                                           5,0      g Dextrosa                                                                                                                            1,0      g Agar                                                                                                                                    2,0      g Bromocresol púrpura                                                                                                       0,02               g Agua                                                                                                                            1000,0      ml pH final 6,5 ± 0,2 Disolver el medio deshidratado en un litro de agua, remojar unos 5 minutos, calentar a ebullición. Distribuir porciones de 4 ml en tubos de 10 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. 5.3.3.3 Medio Indol Nitrito (Medio de tripcaseína y nitrato) Peptona de caseína                                                                                                                                      20,0 -------- g Fosfato disódico                                                                                                                                             2,0 --------- g Dextrosa                                                                                                                                                           1,0 ---------- g Nitrato de potasio                                                                                                                                           1,0 ---------- g Agar                                                                                                                                                                   1,0 --------- g Agua                                                                                                                                                                  1000,0 --- ml pH final 7,2 ± 0,2 Suspender el medio deshidratado en un litro de agua. Agregar 2 g de agar en el caso de hacerse movilidad y detección de gas. Calentar agitando continuamente y hervir durante más o menos un minuto hasta disolución total del medio. Envasar en tubos de ensayo hasta la mitad de su altura y esterilizar en autoclave durante 15 minutos. Si se prepara el medio semisólido, dejar que se solidifiquen los tubos en posición vertical. 5.3.3.4 Medio Rojo de Metilo Voges Proskauer (MR-VP) Peptona especial No. 1                                                                                                                                  7,0 -------- g Dextrosa                                                                                                                                                           5,0 ---------- g Fosfato dipotásico                                                                                                                                         5,0 ---------- g Agua                                                                                                                                                                  1000,0 --- ml pH final 6,9 ± 0,2 Disolver el medio deshidratado en un litro de agua, mezclar bien, si es necesario calentar un poco hasta disolución total. Distribuir y esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. 5.3.3.5 Agar Citrato de Simmons Fosfato dehidrogenado de amonio                                                                             1,0      g Fosfato dipotásico                                                                                                           1,0      g Cloruro de sodio                                                                                                             5,0      g Citrato de sodio                                                                                                              2,0      g Sulfato de magnesio                                                                                                      0,2      g Agar                                                                                                                                 15,0      g Azul bromotimol                                                                                                                0,06               g Agua                                                                                                                            1000,0      ml pH final 6,9 ± 0,2 Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, dejar remojar durante 5 a 10 minutos. Mezclar bien y calentar agitando frecuentemente hasta ebullición y completa disolución. Distribuir volúmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Los tubos se dejan enfriar en posición inclinada de manera que el medio de cultivo en el fondo del tubo alcance una profundidad de 1 a 1,5 cm. Se puede emplear también como medio en placas. 5.3.3.6 Caldo urea Urea                                                                                                                                                                  20,0 -------- g Fosfato monopotásico                                                                                                                                  9,1 ---------- g Fosfato de sodio                                                                                                                                            9,5 ---------- g Extracto de levadura                                                                                                                                      0,1 ---------- g Rojo de fenol                                                                                                                                                   0,01 -------- g Agua                                                                                                                                                                  1000,0 --- ml pH final 6,8 ± 0,2 Disolver 38,61 g en 1000 ml de agua, calentando en caso necesario a 60ºC como máximo. Esterilizar por filtración o tras distribución a razón de 3 ml por tubo; o bien esterilizar con cuidado en marmita de vapor durante 5 minutos. No esterilizar en autoclave. 5.3.3.7 Agar lisina hierro (LIA) Peptona de gelatina                                                                                                        5,0      g Extracto de levadura                                                                                                        3,0      g Dextrosa                                                                                                                           1,0      g L-lisina                                                                                                                           10,0      g Citrato férrico-amónico                                                                                                  0,5      g Trisulfato de sodio (anhidro)                                                                                           0,04     g Bromocresol púrpura                                                                                                       0,02     g Agar                                                                                                                                  15,0      g Agua                                                                                                                            1000,0      ml pH final 6,7 ± 0,2 Suspender el medio deshidratado, remojar unos 15 minutos, calentar para disolver los ingredientes agitando con frecuencia y hervir durante un minuto o hasta disolución completa. Distribuir en porciones de 4 ml en tubos con tapón de rosca de 13 x 100 mm. Esterilizar en autoclave 12 minutos a 121ºC. Dejar solidificar en posición inclinada a tener 4 cm de un extremo y 2,5 cm sesgado. Cerrar con cuidado las tapas a fin de evitar pérdidas de agua por evaporación. 5.3.3.8 Agar de hierro y triple azúcar. (Agar TSI) Mezcla de peptonas                                                                                                     20,0      g Cloruro de sodio                                                                                                              5,0      g Lactosa                                                                                                                           10,0      g Sacarosa                                                                                                                        10,0      g Dextrosa                                                                                                                            1,0      g Sulfato de amonio férrico                                                                                               0,2      g Rojo fenol                                                                                                                             0,025                 g Agar                                                                                                                                  13,0      g Tiosulfato de sodio                                                                                                         0,2      g Agua                                                                                                                            1000,0      ml pH final 7,3 ± 0,2 Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando frecuentemente hasta ebullición y completa disolución. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar a 118ºC durante 15 minutos. Los tubos se deben enfriar en posición inclinada de manera que el medio de cultivo en el fondo del tubo alcance una profundidad de 1,5 a 2,0 cm. 5.3.3.9 Agar DNA azul toluidina Acido desoxirribonucleico (DNA)                                                                                                          0,3                 g Agar                                                                                                                                                            10,0               g Cloruro de calcio (anhidro)                                                                                                0,0011        g Cloruro de sodio                                                                                                                                            10,0 -------- g Azul O toluidina                                                                                                                  0,083             g Tris (hidroximetil) aminometano                                                                                                                 6,1 ---------- g Agua                                                                                                                                                                  1000,0 --- ml Disolver el Tris (hidroximetil) aminometano en un litro de agua. Ajustar el pH a 9.0, adicionar los demás ingredientes excepto el azul O toluidina y calentar a ebullición para su disolución. Añadir al medio el color azul O toluidina. Distribuir en cajas Petri o portaobjetos. 5.3.3.10 Caldo de lisina y descarboxilasa Peptona de gelatina                                                                                                        5,0      g Extracto de levadura                                                                                                        3,0      g Dextrosa                                                                                                                           1,0      g L-Lisina                                                                                                                            5,0      g Púrpura de bromocresol                                                                                                 0,02     g Agua                                                                                                                            1000,0      ml pH final 6,8 ± 0,2 Disolver el medio deshidratado en un litro de agua. Distribuir en porciones de 5 ml en tubos con tapón de rosca. La tapa debe de estar algo floja para permitir un buen intercambio de gases. Apretarla bien al terminar la esterilización. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. 5.3.3.11 Medio SIM Peptona de caseína                                                                                                                                20,0 ------------- g Peptona de carne                                                                                                                                    6,1 -------------- g Sulfato de hierro y amonio                                                                                                                     0,2 --------------- g Tiosulfato de sodio                                                                                                                                  0,2 --------------- g Agar                                                                                                                                                            3,5 --------------- g Agua                                                                                                                                                           1000,0 -------- ml pH final 7,3 ± 0,2 Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, agitando frecuentemente. Remojar durante 10 minutos y hervir a ebullición durante un minuto. Distribuir en tubos de ensayo a una altura de unos 4 cm y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. 6 Material y equipo 6.1 Material. Matraces Erlenmeyer de 2000, 1000, 500, 200 y 100 ml Pipetas serológicas en 1/10 de 1, 2, 5, 10, 25 ml Vasos de precipitados de 80 y 500 ml Probetas de 100, 500 y 1000 ml Embudos de vidrio Cajas de Petri 20 x 100 mm y 15 x 100 mm Pipetas Pasteur Tubos de ensaye 16 x 150 mm Botellas de 100 ml para dilución con tapón de rosca Botellas de dilución de leche de 250 ml Codos de vidrio Termómetros graduación de - 10 a 200°C Portaobjetos Papel parafilm Marcador Masking tape Gasa y algodón Bolsas estériles de polietileno Whirl Pack Membrana de 0.45µ Porta filtro 6.2 Equipo. Estufa a 35 ± 2° C Estufa a 30 ± 1°C              Refrigerador            Balanzas analítica y granataria           Potenciómetro          Autoclave            Horno para esterilizar          Recipiente para material contaminado Espátulas Microespátulas Microscopio Baño maría Cuenta colonias Asa y porta asa Pinzas y tijeras Esterilizar el material y equipo en autoclave (a 121ºC durante 15 min) u horno (170-180ºC durante 2 horas) según sea conveniente. 6.2.1 Cepas de referencia Staphylococcus aureus (ATCC 6538) Escherichia coli (ATCC 11105, 10536) Salmonella tiphy (LNA 99) Pseudomona aeruginosa (ATCC 15442, 25619) 7 Cuenta total de hongos, levaduras y mesofílicos aerobios 7.1 Toma de muestra (del producto) 7.1.1 Analizar la muestra tan pronto como sea posible. Si es necesario almacenar, debe hacerse a la temperatura ambiente. 7.1.2 No incube, refrigere o congele las muestras antes o después de su análisis. 7.1.3 Inspeccione las muestras cuidadosamente antes de abrirlas, y anote cualquier irregularidad del contenedor de dichas muestras. 7.1.4 Desinfecte la superficie del contenedor con un algodón estéril impregnado con una mezcla acuosa de alcohol al 80% (v/v) y ácido clorhídrico 1% (v/v) ( alcohol ácido ). 7.1.5 Antes de abrir y tomar la muestra o contenido, secar la superficie con gasa estéril. 7.1.6 Homogeneizar el producto al tomar la muestra necesaria de acuerdo a su estado físico. Para líquidos, agitar el contenido del envase; para semisólidos y polvos mezclar el contenido con una espátula estéril; para sólidos, raspar el producto con espátula estéril y tomar una muestra representativa y para aerosoles, después de limpiar asépticamente el recipiente, expeler apropiadamente la cantidad de producto previa agitación. 7.2 Preparación preliminar de las muestras. 7.2.1 Para las muestras que sean miscibles en caldo Letheen modificado (CLM) y Caldo Dextrosa Sabouraud (CDS), adicionar   1 g o ml en 90 ml de Caldo Letthen modificado (CLM) y 1 g o ml en 90 ml de Caldo Dextrosa Sabourand (CDS) en condiciones asépticas. 7.2.2 Para las muestras que no sean miscibles en (CLM) y (CDS), (ejem. cremas, labiales etc.), en 2 frascos estériles o bolsas de polietileno Whirl Pack debidamente etiquetados; uno para (CLM) y otro para (CDS), adicionar 1 g o 1 ml de la muestra y agregar 0,5 ml de tween 80 estéril a cada uno de los frascos o bolsas previamente marcados y homogeneizar la muestra. 7.2.3 En caso de usar los frascos poner en baño maría a 45ºC hasta formar una emulsión homogénea (el tiempo de exposición en el baño no debe exceder de 15 minutos) 7.2.4 Posteriormente, agregar a cada uno de los frascos 90 ml de (CLM) y 90 ml de (CDS) respectivamente, y agitar perfectamente. 7.3 Procedimiento 7.3.1 Incubar a 30ºC ± 2 durante 7 días los medios de cultivo inoculados. Marcar los frascos que se enturbien al agregar la muestra. 7.3.2 Confirmar si existe crecimiento a los 2 y 7 días de incubación 7.3.3 Cuando el crecimiento sea evidente o se tenga duda de desarrollo microbiano, hacer una resiembra en (ALM) y (AEM), inoculando 0,5 ml de cultivo del (CLM) y (CDS) respectivamente, empleando el método de vaciado en placa o de dispersión con codos de vidrio esterilizado. 7.3.4 Incubar durante 4 días a 30ºC ± 2 7.4 Interpretación de resultados. Observar si hay crecimiento en los medios inoculados: 7.4.1 Si no hay crecimiento reportar: menos de 10 UFC/ml o g de muestra y en observaciones escribir: ausencia de microorganismos viables. Concluyendo el ensayo. 7.4.2 Si se presenta crecimiento, continuar con la prueba definitiva que se describe a continuación. 7.5 Cuenta total de mesofílicos aerobios, hongos y levaduras. 7.5.1 Procedimiento 7.5.1.1 Agregar por separado 10 ml o g de muestra a 90 ml de medio (CDS) y (CLM), (Dilución 10 -1 ) cuando las muestras sean miscibles en éstos. 7.5.1.2 Para las muestras que no son miscibles; en dos frascos o bolsas estériles debidamente etiquetados: uno para (CLM) y otro para (CDS), adicionar 10 g o ml de muestra y colocar 5 ml de tween 80 estéril a cada uno de los frascos o bolsas previamente marcados. En caso de usar los frascos poner en baño de agua a 45ºC hasta formar una emulsión homogénea (el tiempo de exposición en el baño de agua no debe exceder de 15 minutos). 7.5.1.3 Posteriormente agregar a cada uno de los frascos o bolsas 85 ml de (CLM) y 85 ml de (CDS) respectivamente, y agitar perfectamente. (Dilución 10 -1 ) A partir de la dilución 10 -1 realizar diluciones seriadas, según el crecimiento esperado de la siguiente manera:               TUBO                  DILUCION                   VOL. AGREGADO                          (CLM) o (CDS)                                                                                                                          (ml)                    1                            10 -2 o 1:100                                      1 ml de dilución 10 -1                           9                    2                             10 -3 o 1:1000                                     1 ml de dilución 10 -2                           9                    3                             10 -4 o 1:10 000                                   1 ml de dilución 10 -3                           9                    4                             etc. 7.5.1.4 Para la cuenta estándar total realizar las diluciones en (CLM) y para la cuenta de hongos y levaduras realizar las diluciones utilizando el (CDS). 7.5.1.5 Mezclar hasta homogeneizar 7.5.1.6 Colocar 1 ml de cada dilución en cajas de petri estériles previamente marcadas con la dilución, registro y fecha, agregar de 18 a 20 ml de medio de cultivo cuidando que la temperatura no sea mayor de 45ºC, para cuenta estándar total utilizar (ALM) y para cuenta de hongos y levaduras emplear (AEM) o Agar papa dextrosa. 7.5.1.7 Homogeneizar el inóculo en el medio de cultivo, rotando la caja sembrada de izquierda a derecha, vertical y horizontalmente 6 veces en cada ocasión. 7.5.1.8 Dejar solidificar el medio de cultivo en las cajas. 7.5.1.9 Si se emplea el método de dispersión con codos de vidrio, utilizar 0,5 ml de inóculo por cada dilución y colocarlo en cajas de Petri conteniendo (ALM) y (AEM) para cuenta estándar total y cuenta de hongos y levaduras respectivamente. 7.5.1.10 Dispersar el inóculo con codos de vidrio estériles. 7.5.1.11 Dejar que se absorba el inóculo. 7.5.1.12 Invertir las cajas e incubar: a 30°C ± 2 durante 48 horas para la cuenta estándar total; a 22ºC durante 5 días para la cuenta de hongos y a 35 °C por 48 horas para la cuenta de levaduras. 7.5.2 Interpretación de resultados 7.5.2.1 Cuenta total de hongos y levaduras 7.5.2.1.1 Contar el número de hongos y levaduras que se encuentren 7.5.2.1.2 Reportar el número de colonias /ml o g de muestra multiplicando por el inverso de la dilución observada. 7.5.2.1.3 En el caso de utilizar el método por dispersión de codo de vidrio, el resultado se multiplicará por 2. Concluyendo la prueba 7.5.3 Cuenta total de mesofílicos aerobios 7.5.3.1 Contar las cajas en donde se encuentren de 25 a 250 UFC. 7.5.3.2 Reportar el número de UFC/ml o g de muestra multiplicando por el inverso de la dilución observada. En el caso de utilizar el método por dispersión con codo de vidrio, el resultado obtenido se multiplicará por 2. Para identificación de microorganismos patógenos se continuará con el punto siguiente. 8 Identificación de patógenos 8.1 Procedimiento 8.1.1 Incubar los tubos de la dilución 1:100 o 1:1000 de (CLM) utilizados para la cuenta estándar total, durante 7 días a 30ºC ± 2. 8.1.2 A partir de los tubos inoculados sembrar una asada en los siguientes medios de cultivo diferenciales: agar cetrimida, agar eosina azul de metileno, agar Mc Conkey, agar Vogel- Johnson. 8.1.3 Incubar de 33 a 37ºC durante 24 horas los medios de agar eosina azul de metileno y el Agar Mc Conkey y 48 horas el agar cetrimida y agar Vogel Johnson. 8.1.4 Observar las cajas inoculadas para busqueda de E. coli, S. Typhi, S. aureus y Ps. aeruginosa en los medios respectivos (ver Tabla 1) Tabla No. 1 MEDIO DE CULTIVO                 MICROORGANISMO                            CARACTERISTICAS                                                                                                   COLONIALES Agar eosina azul de metileno        E. coli                                                            Colonias pequeñas azul negro                                                                                                   en la parte central con                                                                                                   brillo   metálico   verdoso                                                                                                   a la luz   reflejada                                              Salmonella                                                  Transparentes, color ámbar                                              Staphylococcus coagulasa (+)                Colonias incoloras, en                                                                                                   punta de alfiler Agar Mc Conkey                                Salmonella, Shigella y otros                    Incoloros, transparentes.                                              E. coli                                                            Grandes rojas, que pueden estar                                                                                                   rodeadas de una zona de                                                                                                   precipitación de bilis                                              Enterobacter, Klebsiella                           Grandes, rosadas, mucosas.                                              Enterococos, Staphylococcus y otros   Diminutas, de crecimiento                                                                                                   aislado, opacas. Agar cetrimida                                   Ps. aeruginosa                                           Pigmento verde -azulado y                                                                                                   fluorescente con luz UV.                                              E. coli                                                           Crece poco, sin pigmento.                                              St. aureus                                                   No crece   Agar Vogel   Johnson                     St. aureus                                                    Colonias pequeñas, negras,                                                                                                   con halo amarillo.                                              S. epidermidis y otros                               Pequeñas, negro-grisáceas,                                                                                                   sin halo.                                              E. coli                                                           No crece                                              Ps. aeruginosa                                           No crece 8.2 Tinción de Gram. Si se observan colonias sospechosas de los microorganismos antes mencionados, de acuerdo a la Tabla No. 1, realizar una tinción de Gram para identificar morfología microscópica. 8.2.1 Procedimiento. Preparar un frotis con microorganismos provenientes de un cultivo de 24-48 hrs. de incubación. Aplicar calor suave al portaobjetos con la llama de un mechero o de una lámpara de alcohol de manera paulatina. El calentamiento no deberá ser excesivo ni violento. Enfriar y aplicar sobre el frotis unas gotas de solución de cristal violeta, dejar actuar un minuto. Lavar con agua y escurrir. Aplicar unas gotas de la solución yodo-yodurada con mordente, dejar actuar un minuto. Lavar con agua y escurrir. Decolorar el frotis con unas gotas de la solución alcohol-acetona, durante no más de 10 segundos. Lavar con agua y escurrir. Aplicar unas gotas de la solución de safranina, dejar actuar entre 15 y 30 segundos. Lavar con agua, inclinar el portaobjeto para dejar escurrir el exceso de agua y secar los bordes con papel secante. 8.2.2 Interpretación de resultados. Observar al microscopio con objetivo de inmersión. 8.2.2.1 Las bacterias Gram positivas, se observan teñidas de color azul violáceo intenso 8.2.2.2 Las Gram negativas se observan de color rojo. 8.3 Identificación de St. aureus En caso de encontrar cocos en racimo Gram positivos, continuar con las siguientes pruebas para búsqueda de St. Aureus.   8.3.1 Prueba de catalasa. 8.3.1.1 Aislar la colonia sospechosa en ALM, incubar a 33-37ºC durante 18-24 horas. 8.3.1.2 Si se observa crecimiento, realizar la prueba de catalasa como se indica a continuación: en un portaobjeto adicionar una gota de solución de agua oxigenada al 3% y dispersar una porción de la colonia sospechosa. La reacción es positiva si se observan burbujas efervescentes del oxígeno desprendido, utilizar controles positivos y negativos. 8.3.1.3 Aislar en agar sal-manitol o Vogel Johnson incubando a 33-37°C durante 24 a 48 hrs. Observar si hay colonias fermentadoras de manitol. 8.3.1.4 Resembrar en medio de oxidación-fermentación con dextrosa, incubar a 33-37°C durante 18-24 hrs, y observar si hay desarrollo microbiano. 8.3.1.5 Sembrar las colonias sospechosas en dos tubos con caldo infusión cerebro corazón, uno destinado para la técnica de coagulasa y otro para la técnica de termonucleasa, incubar a 35°C de 18 a 24 horas. 8.3.1.6 Reportar de acuerdo a la Tabla No. 2 8.3.2 Prueba de coagulasa 8.3.2.1 Procedimiento (método 1) 8.3.2.1.1 Con la ayuda de un asa, transferir individualmente las colonias sospechosas de la cajas en que se desarrollaron de cualquiera de los dos medios de cultivo Sal Manitol, Vogel Johnson para estafilococo a tubos individuales que contengan 0,5 ml de plasma de conejo o de cobayo. 8.3.2.1.2 Incubar en baño maría a 35ºC durante una hora, observar a las 3 horas y despues a distintos intervalos hasta las 24 horas. 8.3.2.1.3 Reportar positiva la prueba si hay formación de coágulo pequeño pero bien constituido o una coagulación total de la mezcla. 8.3.2.1.4 Correr en paralelo el mismo procedimiento con el testigo, éste debe dar la prueba positiva. 8.3.2.2 Procedimiento (método 2) 8.3.2.2.1 Adicionar a cada tubo 0,5 ml de (BHI) caldo infusión cerebro-corazón. 8.3.2.2.2 Transferir cada colonia sospechosa de las cajas en las que se desarrollaron al caldo con ayuda de un asa. Hacer lo mismo con el control positivo. 8.3.2.2.3 Incubar 24 horas a 35ºC. 8.3.2.2.4 Posteriormente adicionar a cada tubo 0,5 ml de plasma. 8.3.2.2.5 Incubar 3 horas en baño de agua, entre 35-37ºC sin movimiento. 8.3.2.3 Interpretación de resultados 8.3.2.3.1 La presencia de un coágulo dará la prueba positiva, de lo contrario se procederá a continuar la incubación hasta 24 horas. 8.3.2.3.2 Si al transcurrir el tiempo no se observa coágulo la prueba se considera negativa. NOTA:No todos los tipos de St. aureus son coagulasa positiva 8.3.3 Prueba de la termonucleasa. Al otro tubo sembrado en caldo infusión cerebro corazón, practicar la prueba de la termonucleasa, corriendo dicha prueba con un control positivo. 8.3.3.1 Procedimiento (método 1) 8.3.3.1.1 En una caja de Petri desechable con 10 ml de medio de cultivo, agar DNA azul toluidina, se efectúan orificios de 2 mm de diámetro. 8.3.3.1.2 Calentar a ebullición 15 minutos el cultivo de Staphylococcus aureus seleccionado. 8.3.3.1.3 Colocar una gota del cultivo obtenido en alguno de los orificios e identificarlo, incubar a 37ºC durante 24 horas. 8.3.3.2 Procedimiento (método 2) 8.3.3.2.1 Inactivar el cultivo en baño maría a ebullición durante 15 minutos. 8.3.3.2.2 En un portaobjetos con agar DNA azul toluidina aplicar en horadaciones de 2 mm de diámetro (previamente realizadas) la muestra y el control positivo. 8.3.3.2.3 Incubar durante 24 horas de 35-37° C. 8.3.3.3 Interpretación de resultados. Transcurrido el tiempo de incubación observar vire del agar de morado a violeta o rosa y la presencia de halo. 8.3.3.3.1 Se da como positiva la prueba con la presencia de un halo color rosa alrededor de los orificios que indican hidrólisis del DNA. Reportar: Staphylococcus aureus termonucleasa positiva. Tabla No. 2 CARACTERISTICAS DIFERENCIALES DE St. aureus DETERMINACION                          St.aureus                       S.epidermidis                     Micrococcus sp Pruebas de catalasa                                     +                                                -                                                - Fermentación de manitol                             +                                                -                                                - Crecimiento en O/F                   fermentativo                                                                                                 Prueba de Coagulasa                                  +                                                -                                                - Prueba de Termonucleasa                          +                                                                                                 Vogel Proskauer                                            +                                                                                                - Oxidasa                                                             -                                                                                                - Reducción de nitratos                                   +                                                                                               d d= variable      8.4 Pruebas bioquímicas empleadas. 8.4.1 Prueba de Oxidasa. La prueba de oxidasa se realiza de la siguiente manera: impregnar una tira de papel filtro en diclorhidrato de N-N dimetil p-fenilendiamina y sobre ella colocar una porción de la colonia sospechosa. La prueba es positiva si se produce un color que va de rosa a púrpura. 8.4.2 Prueba en medio de hierro y triple azúcar (TSI). Sembrar el cultivo puro sometido a ensayo tanto por estría en la superficie inclinada como en la columna vertical, mediante estría central. Incubar 48 horas a 37ºC. 8.4.2.1 Interpretación de resultados. A =           Viraje a rojo por formación de álcali. OA =        Sin alteración del color original del medio de cultivo o rojo por formación de álcali. S =           Viraje a amarillo, por formación de ácido. SG =        Viraje a amarillo y formación de gas. + =           Ennegrecimiento por formación de H 2 S. - =            Ausencia de ennegrecimiento. 8.4.3 Prueba en agar de hierro y lisina (LIA). Sembrar el cultivo puro sometido a ensayo, tanto por estría sobre la superficie inclinada como por picadura central en la columna vertical subyacente. Incubar de 16-18 horas a 37ºC. 8.4.3.1 Interpretación de resultados. Violeta = Viraje del indicador de pH púrpura de bromocresol por la descaboxilación de lisina y la consecuente alcalinidad. Amarillo= Fermentación de glucosa con la consecuente acidez del medio. Negro = Formación de coloración negra por el H 2 S y producción de sulfato de hierro.   8.4.4 Prueba en medio basal O/F (de Hugh y Leifson). A partir del cultivo puro sometido a ensayo, que se encuentre lo más posible en la fase logarítmica de multiplicación, sembrar por el procedimiento de picadura hasta el fondo, un tubo con recubrimiento de parafina y otro tubo sin tal recubrimiento para cada carbohidrato elegido. Incubar 48 horas como mínimo a la temperatura de 35ºC. 8.4.4.1 Interpretación de resultados. Amarillo en ambos tubos = Fermentación del correspondiente carbohidrato. Amarillo en tubo no recubierto = Degradación oxidativa del carbohidrato. Oxidación en la superficie. Movilidad = Si la turbidez se extiende en la totalidad del medio. Gas = Observar formación de gas. 8.4.5 Prueba en agar citrato de Simmons. Sembrar el cultivo puro por estría, en la superficie del medio de cultivo e incubar de 24 a 48 horas a 37ºC. 8.4.5.1 Interpretación de resultados. Positivo = Medio de cultivo azul oscuro Negativo o inhibido = Sin cambio 8.4.6 Prueba en caldo urea. Sembrar masivamente con el cultivo puro objeto de ensayo. Incubar hasta 48 horas a 37ºC. 8.4.6.1 Interpretación de resultados. Rojo = Urea positivo Amarillo = Urea negativo 8.4.7 Prueba en medio MR-VP. 8.4.7.1 Procedimiento. Sembrar en dos tubos de caldo MR-VP con el cultivo puro objeto de investigación. Incubar hasta 4 días a 37ºC. A continuación se realizan los ensayos: 8.4.7.1.1 Prueba del rojo de metilo: añadir al primer tubo unas 5 gotas de la solución indicadora de rojo de metilo. 8.4.7.1.2 Prueba de Voges-Proskauer: al segundo tubo se le añaden 5 ml de la solución de sulfato de cobre según Leifson o 3 ml de reactivo de Barritt y un ml de hidróxido de potasio al 40% o 5 ml de reactivo de O'Meora. En caso positivo se presenta para los dos primeros métodos después de algunos minutos, un viraje a rojo. Con el reactivo de O'Meora aparece en caso positivo y tras frecuente agitación, una coloración rosa al cabo de unos 20 minutos, iniciándose en la superficie y que se intensifica en el transcurso aproximado de 2 horas. 8.4.7.2 Interpretación de resultados. De anaranjado a rojo = positivo por utilización de glucosa. De anaranjado a amarillo = negativo. Rojo = Positivo, por formación de acetoína a partir de glucosa. Sin reacción = negativo. 8.4.8 Prueba en medio indol nitrito. 8.4.8.1 Formación de nitritos: 8.4.8.1.1 Para investigar nitritos utilice 3 tubos separados; uno para el control positivo (E. coli), otro para el control negativo y el tercero para la prueba con la cepa en estudio. 8.4.8.1.2 Inocule masivamente cada tubo por punción. 8.4.8.1.3 Incube a 35ºC de 12 a 24 horas. 8.4.8.1.4 Agregue aproximadamente 10 gotas (mezcla de partes iguales de las soluciones A+B) del reactivo Griess-Ilosvays. 8.4.8.2 Interpretación de resultados. 8.4.8.2.1 La formación de un color rojo en uno o 2 minutos indica reducción de nitratos a nitritos (prueba positiva). Si la cantidad de nitritos es elevada el color rojo cambia a amarillo. 8.4.8.2.2 Si no aparece color, agregue a los tubos una pizca de zinc en polvo (libre de nitratos y de nitritos). 8.4.8.2.3 Observe si se forma el color rojo o el cultivo permanece incoloro. 8.4.8.2.4 Si no hubo reducción del nitrato presente en el medio de cultivo por el microorganismo, el zinc lo reducirá a nitrito y se formará un color rojo al reaccionar con el reactivo de Griess-Ilosvays. La prueba entonces será negativa. (Ausencia de nitratasa). 8.4.8.2.5 Si no aparece color, esto nos indica que el germen redujo el nitrato presente en el medio de cultivo hasta más allá de la formación de nitritos, posiblemente llegando la reacción hasta nitrógeno gaseoso. La prueba entonces es positiva. (Presencia de nitratasa). 8.4.8.3 Formación de indol. 8.4.8.3.1 Recubrir el medio con una capa de aproximadamente 0.5 cm de altura del reactivo del indol según Kovacs. 8.4.8.3.2 En presencia del indol libre, se presenta al cabo de pocos minutos una coloración rojo cereza en la capa del reactivo. 8.4.9 Prueba en medio SIM. 8.4.9.1 Procedimiento. 8.4.9.1.1 El cultivo puro sometido a examen se siembra por punción en la capa superior del medio de cultivo y se incuba de 18-24 horas a 37ºC. 8.4.9.2 Interpretación de resultados. 8.4.9.2.1 La movilidad se pone de manifiesto por la turbidez difusa del medio de cultivo alrededor del canal de la picadura. 8.4.9.2.2 La no movilidad se caracteriza por el crecimiento producido exclusivamente a lo largo de dicha canal. La formación de H 2 S se reconoce por el ennegrecimiento de la zona de crecimiento. 8.4.9.2.3 La demostración del indol se efectúa mediante el reactivo de Kovacs. La formación del indol da lugar a una coloración rojo púrpura de la capa de reactivo. 8.4.9.2.4 También puede usarse con el mismo propósito la tira de papel filtro impregnada con una solución de ácido oxálico. Esta se coloca seca en la boca del tubo, virando a un color rosado en el caso de formación de indol. 8.4.10 Prueba en medio MIO. 8.4.10.1 Procedimiento. 8.4.10.1.1 Los cultivos son inoculados por punción en el medio MIO preparado en tubos y se incuban de 18-24 horas a 35ºC. 8.4.10.1.2 Se leen las reacciones de movilidad y de ornitina descarboxilasa antes de agregar el reactivo de Kovacs para la prueba de indol. 8.4.10.2 Interpretación de resultados. 8.4.10.2.1 La movilidad es indicada por turbidez del medio o por crecimiento extendido a partir de la línea de inoculación. 8.4.10.2.2 La ornitina descarboxilasa es indicada por el color púrpura del medio. 8.4.10.2.3 La ornitina negativa produce un color amarillo, en el fondo puede ser púrpura al final. 8.4.10.2.4 Para la prueba de indol se añaden de 3-4 gotas de reactivo de Kovacs y se agita suavemente el tubo. La aparición de color rosa o rojo en el reactivo se interpreta como prueba positiva de indol. Comparar los resultados obtenidos con un tubo testigo sin sembrarse. 8.4.11 Prueba en caldo lisina descarboxilasa. 8.4.11.1 Procedimiento. 8.4.11.1.1 Los tubos con el caldo se inoculan con los microorganismos de prueba y se incuban durante 24 horas de 32-35ºC o si se prefiere a 37ºC. 8.4.11.1.2 Los bacilos entéricos producen ácido en la fermentación inicial de dextrosa ocasionando un cambio de color amarillo. 8.4.11.1.3 Los cultivos que también producen descarboxilación de la lisina, forman cadaverina y el caldo vuelve a tomar el color púrpura alcalino. 8.4.11.2 Interpretacón de resultados. 8.4.11.2.1 Un color amarillo después de 24 horas indica un resultado negativo. 8.4.11.2.2 El color púrpura es un resultado positivo que indica la descarboxilación de la lisina. 8.5 Identificación de bacterias Gram negativas. 8.5.1 Pruebas para identificación de Pseudomona aeruginosa. 8.5.1.1 Procedimiento. 8.5.1.1.1 En caso de que en el medio agar cetrimida se encuentren colonias sospechosas de Pseudomona aeruginosa (tabla No. 1) sembrarlos en cada uno de los medios agar Pseudomonas F para detección de fluoresceína y agar Pseudomonas P para detección de piocianinas e incubar a 35 ± 2ºC durante no menos de tres días. 8.5.1.1.2 Observar con luz ultravioleta las colonias desarrolladas y comparar la morfología colonial conforme a la tabla No. 3. Tabla No. 3 CARACTERISTICAS DE Pseudomona aeruginosa Medio de cultivo                                 Morfología colonial                       Tinción de Gram        Prueba de oxidasa Agar Cetrimida a                               Colonias verde azulosas, con    Bacilos                                          + 37ºC y/o 42ºC                                      luz ultravioleta se observan         -                                                                                                       de color verdoso.                                                                                    Agar Pseudomonas F                      Colonias incoloras o                    Bacilos                                          +   para obtención                                   amarillentas, de fluoresceína                                   con luz ultravioleta                         -                                                                                                       se observan de color                                                                                                                           amarillento.                                                                                             Agar Pseudomonas P para            Colonias verde-azulosas.           Bacilos                                          + detección de piocianina                    Con luz ultravioleta se                  -                                                                                                       observan de color azul.                                                                         8.5.1.2 La presencia de Pseudomona aeruginosa puede confirmarse si es necesario con pruebas bioquímicas mencionadas en los puntos del 8.4.1 al 8.4.11 y comparar con la Tabla No. 4. Tabla No. 4 Pseudomona aeruginosa Pruebas bioquímicas                                   Resultado H 2 S (formación)                                                   - Movilidad                                                              + Indol                                                                       - Urea                                                                      d Lisina Descarboxilasa                                       - Lactosa                                                                 - VP                                                                           - Citrato de Simmons                                          + Manitol                                                                  d Glucosa (gas)                                                     + Sorbitol                                                                  - Ornitina Descarboxilasa                                    - Inocitol                                                                   - Arabinosa                                                             - Ramnosa                                                             - OF/F                                                                       - OF/O                                                                     + + = Positivo - = Negativo d = Variable 8.5.2 Pruebas para identificación de Salmonella sp. En caso de que en los medios agar EMB o McConkey se encuentren colonias sospechosas de Salmonella (cuadro No. 1) sembrarlas en medio caldo cistina-selenito y caldo tetrationato, incubar durante 12- 24 horas a 37ºC o 43ºC. 8.5.2.1 Pruebas selectivas para Salmonella sp. 8.5.2.1.1 Si se presenta crecimiento en cualquiera de los medios de enriquecimiento, tomar una asada y aislar por estría cruzada en los siguientes medios: agar verde brillante, agar xilosa-lisina desoxicolato y agar sulfito de bismuto. 8.5.2.1.2 Si son bacilos Gram negativos, correspondiendo a la morfología de Salmonella sp., sembrar por estría y punción en el medio agar triple azúcar-fierro e incubar de 18 a 24 horas a 35ºC. 8.5.2.1.3 Observar las morfologías coloniales y microscópicas y compararlas con las descritas en la Tabla No. 5. Tabla No. 5 CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS DE Salmonella sp. Medio de cultivo                                               Características morfológicas                        Tinción de Gram Agar verde brillante.                                   Colonias pequeñas transparentes,              Bacilos                                                          incoloras, rosas o blancas opacas,              -                                                          frecuentemente rodeadas de                                                                                  una zona rosa o roja.                                         Agar xilossa-lisina desoxicolato.             Colonias rojas con o                                        Bacilos                                                          sin centro negro.                                                - Agar sulfito de bismuto.                            Colonias negras o verdes.                               Bacilos                                                                                                                     - Agar fierro triple azúcar.                             Superficie alcalina (roja)                                  Bacilos                                                          punción ácida (amarilla),                                 -                                                          con o sin producción de ácido                                                                                sulfhídrico (negro).                                             8.5.2.2 Para confirmación de Salmonella realizar las pruebas bioquímicas mencionadas en los puntos del 8.4.1 al 8.4.11 y comparar con la Tabla No. 6. Tabla No. 6 Salmonella typh i Pruebas   bioquímicas                                                                                          Resultado TSI:                Superficie                                                                                                    K                  Punción                                                                                                       A                  Gas                                                                                                              -                  H 2 S                                                                                                                + LIA:                Superficie                                                                                                    K                  Punción                                                                                                       K                  Gas                                                                                                              -                  H 2 S                                                                                                                + (-) MIO:               Movilidad                                                                                                     + (-                  Indol                                                                                                             )                  Ornitina                                                                                                         -   Urea                                                                                                                                    - Lisina Descarboxilasa                                                                                                    + Malonato                                                                                                                            - Lactosa                                                                                                                              - VP                                                                                                                                        - Citrato de Simmons                                                                                                        - Manitol                                                                                                                                + Glucosa (gas)                                                                                                                   - Sorbitol                                                                                                                               + Ornitina Descarboxilasa                                                                                                 - Dulcitol                                                                                                                               d Inocitol                                                                                                                                - Triolosa                                                                                                                              + Arabinosa                                                                                                                          - Ramnosa                                                                                                                           - Celobiosa                                                                                                                          d Eritritol                                                                                                                                - Acetato de sodio                                                                                                               - Mucato                                                                                                                                - Fucsina glicerol                                                                                                                - K= Alcalino A= Acido += Positivo -= Negativo d= Variable 8.5.3 Pruebas selectivas para Escherichia coli. 8.5.3.1 Procedimiento. 8.5.3.1.1 En caso de que encuentren colonias sospechosas de E. coli (Tabla No. 1) sembrar por estría cruzada en los medios agar Mc Conkey y agar Levine-eosina azul de metileno e incubar a 35ºC. 8.5.3.1.2 Observar el crecimiento y si ninguna colonia corresponde a la morfología descrita en la Tabla No. 1, la muestra cumple los requisitos de ausencia de Escherichia coli. 8.5.3.2 Confirme la presencia utilizando las pruebas bioquímicas mencionadas en los puntos 8.4.1 al 8.4.11 y comparar con la Tabla No. 7. Tabla No. 7 Escherichia coli Pruebas bioquímicas                                                                                           Resultado TSI:                      Superficie                                                                                                   A                      Punción                                                                                                       A                      Gas                                                                                                              +                      H 2 S                                                                                                                  - LIA:                      Superficie                                                                                                   K                      Punción                                                                                                       A                      Gas                                                                                                              +                      H 2 S                                                                                                                  - MIO:                     Movilidad                                                                                                + (-)                      Indol                                                                                                               + Urea                                                                                                                                            - Lisina Descarboxilasa                                                                                                           + Malonato                                                                                                                                    - Lactosa                                                                                                                                     + VP                                                                                                                                                - Citrato de Simmons                                                                                                                - Manitol                                                                                                                                       + Glucosa (gas)                                                                                                                          A Sorbitol                                                                                                                                      + Ornitina Descarboxilasa                                                                                                        d Dulcitol                                                                                                                                      d Inocitol                                                                                                                                        - Triolosa                                                                                                                                     + Arabinosa                                                                                                                                 + Ramnosa                                                                                                                                 d Eritritol                                                                                                                                        - OF/F y OF/O                                                                                                                              + Mucato                                                                                                                                       + K = Alcalino A = Acido + = Positivo - = Negativo d = Variable 8.6 Pruebas bioquímicas API. 8.6.1 Procedimiento. 8.6.1.1 Aislar la colonia sospechosa en ALM y los medios diferenciales que se mencionan: agar eosina azul de metileno (E. coli), agar   McConkey (S. typhi) y agar cetrimida (Ps. aeruginosa). 8.6.1.2 Incubar a 33-37ºC durante 18 a 24 horas. 8.6.1.3 Sembrar el sistema API, siguiendo las indicaciones del fabricante. 8.6.1.4 Leer las bioquímicas e identificar al microorganismo haciendo uso del manual de códigos. 8.6.1.5 Corroborar que la morfología colonial de los medios diferenciales sea la correspondiente al microorganismo identificado por el sistema API. 8.7 Diagrama para identificación de patógenos.   Ver imagen (dar doble click con el ratón)   9 Observancia de la Norma La vigilancia en el cumplimiento de la presente Norma corresponde a la Secretaría de Salud. 10 Concordancia con normas internacionales Esta Norma no tiene concordancia con normas internacionales. 11 Bibliografía 11.1 Secretaría de Salud. Ley General de Salud. 1984. 11.2 Secretaría de Salud. Modificaciones a la Ley General de Salud. 1991. 11.3 Secretaría de Salud. 1988. Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Control Sanitario de Actividades, Establecimientos, Productos y Servicios. 11.4 Secretaría de Salud. 1988. Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos. 5a. Ed. páginas 201-209. 11.5 Secretaría de Comercio y Fomento Industrial. Ley sobre Metrología y Normalización. 1992. 11.6 FDA Bacteriological Analytical Manual. 1984.   Microbiological Methods for Cosmetics. Joseph M. Madden and Hugh Dallas. 6th. Edition. Chapter 25. 11.7 Apha, 1976. Compendium of methods for the microbiological examinated of food. Ed. M.L. Speck. Washington, D.C. 11.8 Amador, L.R. 1982. Determinación de la enterotoxigenidad de capas de Staphylococcus aureus aisladas de productos cárnicos. Tésis profesional E.N.C.B. I.P.N. México, D.F. 11.9 American Public Health Association. 1976. Compendium Methods for the Microbiological   examination of foods. Intersociety Agency Committee on Microbiology Methods for Foods. Ed. Marvin L. Speck. páginas 399-407. 11.10 Bacterological Analitical Manual. 1984. 6a. Edición. Capítulo 25 páginas 25-26. 11.11 Cook M. Osol L. Van Metek T. 1985. Farmacia Práctica de Regmington. 2a. Ed. UTEHA. 11.12 CTFA Microbiology Committee. 1985. Determination of the Microbial Content of Cosmetic Products (M-1) Microbiological Methods Section of the CTFA Technical Guidelines. 11.13 Deacon J.W. 1990. Introducción a la Micología Moderna. Ed. Limusa, S.A. de C.V. páginas 11-16. 11.14 Difco. Manual. 1974. 9th. Ed. Difco Laboratories Detroit Michigan U.S.A. páginas 501-508. 11.15 Don J.J.J. Farmer III. Hickman F.W. Asbury M.A. and Steigerwalt A.G. 1977. Enterobacteriaceae. Center for Discase Control Atlants. G.A. página 78. 11.16 Dr. Bradshaw L.J. 1973. Microbiología de Laboratorio. Ed. El Manual Moderno, S.A. de C.V. páginas 228-229. 11.17 Ewing W.H. and Martin W.J. 1980. Enterobacteriaceae Manual of clinical microbiology. Lennette E.H. Spaulding E.H. and Traunt J.P. Editors 2nd ed. American Society for Microbiology. Washington, D.C. página 207. 11.18 Ewing W.H. and Martin W.J. 1973. Enterobacteriaceae Manual of clinical microbiology. Editors 2nd. ed. American Society for Microbiology. Washington, D.C. páginas 15-16. 11.19 Herrera T. Ulloa M. 1990. El reino de los Hongos. Micología básica y aplicada. Universidad Nacional Autónoma de México, Fondo de Cultura Económica. páginas 19-23. 11.20 I.P.N. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. 1983. Manual de Laboratorio de Microbiología Sanitaria 1ra. Ed. página 166. 11.21 Jay. J.M. 1978. Modern Food Microbiology Second. Ed. páginas 321-347. 11.22 Lachica R.V.C. Genigeorgis y Horeprich P.D. 1971. Methacromatic agar Difusion Method for detecting   Staphylococcal cleasa activity. Appl. microbiol 21 : 585-587. 11.23 Lachica R.V.C. Weiss V.F. y Deibel R.H. 1969. Relationships among coagulase. enterotoxin and heat stable deoxyribonucleasa. production by Staphylococcus aureus. Appl. Microbiol 18 : 126-127. 11.24 Lennette E.H. Spaubling y Traunt J.P. 1980. Enterobacteriaceas Manual of clinical microbiology. Edition 2nd. American Society for Microbiology Washington, D.C. página 207. 11.25 MacFaddin J.F. 1980. Biochemical test for identification of Medical Bacteria. páginas 220-226. 11.26 MacFaddin J.F. 1976. Biochemical test for Identification of Medical Bacteria. The Williams & Wilkins Co. Baltimore USA. 11.27 Merck E. 1990. Manual de Medios de Cultivo. Darnotadt Alemania. páginas 206-207. 11.28 Norma Oficial Mexicana NOM-Z-13-1977. Guía para la redacción, estructuración y presentación de la Normas Oficiales Mexicanas. 11.29 Ramírez. V.M.P. 1983. Correlación entre las pruebas de coagulasa y producción de enterotoxina de cepas de Staphylococcus aureus aisladas de productos cárnicos. Tesis profesional E.N.C.B., I.P.N., México, D.F. página 84. 11.30 Reyes. H.M.L. 1981. Determinación de la enterotoxigenicidad de cepas aisladas de quesos. Tesis profesional. E.N.C.B., I.P.N., México, D.F., págs. 64 y 346. 11.31 Rodríguez. M.R. 1980. Determinación de la toxigenicidad de cepas de Staphylococcus aureus. Tesis profesional E.N.C.B., I.P.N.,   México, D.F. página 78. ## CONTINUACION a las respuestas de los comentarios recibidos, respecto del Proyecto de Norma Oficial Mexicana NOM-089-SSA1-1994, Bienes y servicios. Métodos para la determinación del contenido microbiano en productos de belleza. Tipo de publicación: otra_publicacion Relación con la ficha: historial Fuente del documento: https://sidof.segob.gob.mx/notas/docFuente/4874500 [Documento con formato](/normas/nom-089-ssa1-1994/documentos/dof-4874500/) Texto derivado para búsqueda; consultar el documento con formato para tablas e imágenes.     Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.- Secretaría de Salud. CONTINUACION DE RESPUESTAS A LOS COMENTARIOS RESPECTO DEL PROYECTO DE NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-089-SSA1-1994. BIENES Y SERVICIOS. METODOS PARA LA DETERMINACION DEL CONTENIDO MICROBIANO EN PRODUCTOS DE BELLEZA publicado, en el Diario Oficial de la Federación el 4 de agosto de 1994. La Dirección General de Control Sanitario de Bienes y Servicios, por acuerdo del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario; con fundamento en los artículos 39 de la Ley Orgánica de la Administración Pública Federal; 1o., 47 fracción III de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización y 13 fracción I del Reglamento Interior de la Secretaría de Salud, ordena la publicación de la continuación de las respuestas a los comentarios recibidos al Proyecto de Norma Oficial Mexicana NOM-089-SSA1-1994. BIENES Y SERVICIOS. METODOS PARA LA DETERMINACION DEL CONTENIDO MICROBIANO EN PRODUCTOS DE BELLEZA. La Dirección General de Control Sanitario de Bienes y Servicios consideró indispensable hacer la siguiente aclaración con respecto a la Respuesta a los comentarios recibidos, publicada el 2 de febrero de 1995, en lo que se refiere a los puntos 3.6, 5.3.1.15, 6.2.1, 7.1.4, 7.5.1.6 y 8.3.3.1.2 corresponden a las observaciones enviadas por la Cámara Nacional de la Industria de Perfumería y Cosmética. Los puntos 7.2, 7.3, 7.4 y 8.5.1 corresponden a The Cosmetic Toiletry and Fragance Association. En cuanto a la respuesta donde se indica que no se acepta la inclusión de otros métodos, corresponde a ambos promoventes. Asimismo, la Dirección General de Control Sanitario de Bienes y Servicios con base a los comentarios expresados por el Subcomité de Control Sanitario de Bienes y Servicios, consideró necesario incluir modificaciones indispensables para la comprensión de la Norma Oficial Mexicana , como las siguientes: En el Apartado de Símbolos y abreviaturas se incluirá la abreviatura de número (No.) que se omitió. En el punto 5.3.2.1.4 se adecuará el número de referencia, conforme la nueva numeración. En el punto 7.5.1.3 se completará la palabra "volumen" en el cuadro de diluciones así como en el punto 8.3.2.1.1 la denominación del medio de cultivo "agar sal y manitol". En el punto 8.5.2 se subrayará o se cambiará a letra cursiva el nombre del microorganismo " Salmonella " que se encuentra dentro del texto. En general en toda la Norma, se eliminan los nombres de los medios de cultivo, quedando únicamente la abreviatura (sin paréntesis) de aquéllos que se encuentran en el Apartado de Símbolos y abreviaturas. Cabe mencionar que todas las modificaciones realizadas son para mejor comprensión de la Norma Oficial Mexicana, respetándose el contenido técnico tal como fue concertado. Atentamente Sufragio Efectivo. No Reelección México, D.F., a 13 de marzo de 1995.- El Director General, José Meljem Moctezuma .- Rúbrica.